MicroRNA功能與研究工具簡介

 

MicroRNA是短鏈RNA(19~22 nt),與目標mRNA(messenger RNA)的3端的非轉譯區(3’ UTR)結合後,去調節基因表現,進而促進或抑制轉譯作用。(註:microRNA又稱miRNA和miR,以下簡稱為miRNA)

在大多數生物體中,miRNA相對於mRNA與蛋白質來說數量較少,然而一個miRNA可能調控多達數百個mRNA,影響重大基因表現網路。

圖一 MicroRNA的生成及功能

生物體中miRNA有三種不同形式的存在,primary miRNA(pri-miRNA)、precursor miRNA(pre-miRNA)及mature miRNA,pri-miRNAs被轉錄後生成約有數百至上千個鹼基的長度,再經過Drosha剪切後形成pre-miRNA,約70~100鹼基,帶有髮夾結構。送出細胞核外後經由Dicer剪切形成mature miRNA,具有功能性且為雙股RNA,約19~22鹼基,由RISC帶miRNA前往目標mRNA結合在3’ UTR從而影響mRNA轉譯作用。

命名miRNA簡要規則:

研究miRNA的方法:

1. 如何取得miRNA:

a. 樣品來源:培養的細胞、血清或其他體液、新鮮或固定的組織或腫瘤

b. 抽取miRNA:與抽RNA方法雷同,有各種核酸萃取試劑或套組可使用

c. 品質評估:分光光度計、Qubit螢光檢測儀及毛細管電泳

2. 應用在細胞處理:

a. Mimics: 模仿生物體內源性miRNA的序列,為人工合成雙股RNA,轉染進細胞增強miRNA與目標基因結合的效果,促進或抑制轉譯作用而影響後續蛋白表現。

b. Inhibitor: 為miRNA的反股序列,主要目標為與內源性miRNA互補結合,而抑制內源性mature miRNA作用。Mimics與inhibitor互為正反向對細胞功能影響的實驗。

c. 載體shRNA: 是一個具有過表達mimics和inhibitor功能的載體,可在細胞內長時間的持續干擾作用,可選擇藥物抗性基因,進行穩定細胞株篩選。

3. 應用在動物實驗:

a. Agomir與Antagomir: 二者為mimics及inhibitor經特殊修飾的RNA,化學修飾包含膽固醇修飾、2-甲氧基修飾及硫代修飾。優點是更容易被轉染,特別適合用於動物體內干擾實驗,相對於未修飾的mimics及inhibitor具有更高的穩定性及抑制效果。

b. 載體shRNA: 藉由病毒包裝後感染動物送進體內,維持較長期的干擾作用。

分析大量miRNA表現量差異方法

主要方法有三種: qPCR、microarray及NGS,經由上述實驗獲得數據,再經由數據的判讀及標準化後便可計算miRNA表現量的差異。

根據不同實驗目的和研究方針,以下流程圖可供選擇實驗策略上的參考

 

 

Reference:

  1. Tingting Du and Phillip D. Zamore microPrimer: the biogenesis and function of microRNA. Development 2005;132, 4645-4652
  2. Colin C. Pritchard, Heather H. Cheng, and Muneesh Tewari. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet 2015;13(5): 358–369
  3. Thermo Fisher RNAi & Epigenetics Sourcebook
  4. Yong Huang, et al.Biological functions of MicroRNAs: A review J Physiol Biochem 2011 67:129–139

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