細胞存活試驗

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當細胞受有毒物質刺激時,會引起細胞整體型態的改變包括:產生空泡或剝離、細胞溶解及細胞膜完整性發生變化,甚至引起細胞死亡現象。相反的,當接觸到有益的物質時,細胞會出現快速的增生。因此,一個快速、方便的實驗方式來探討細胞受刺激後的存活或增生情形就非常重要。

實驗室常用來研究細胞存活的實驗原理不外乎就是利用細胞本身的酵素跟特定受質發生反應後會產生顏色變化來測量其吸光值的改變,進而推算出細胞數量。簡單說,活細胞越多,酵素活性相對較高,吸光值也成正比越高。所以可以用來測量推算出細胞的存活或死亡率。這樣的技術也可以用來針對新穎藥物或生醫材料產品在研發階段中針對製程中半成品實施細胞毒性試驗。

目前常見的細胞存活試驗有MTT試驗,MTT的全名是3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide;是一種黃色、接受氫離子的化合物。MTT主要會被活細胞粒線體中的琥珀酸脫氫酶(SDH)和細胞色素C作用,將四氮唑環開裂產生紫色的甲䐶(formazan)結晶。再利用DMSO將甲䐶溶解出來之後,利用吸光度的測定去評估有多少細胞存活。因為甲䐶結晶的生成量與活細胞數目成正比,利用測吸光度得知細胞還原MTT的能力(甲䐶的形成量),此吸光度代表了粒線體的活性,即活細胞數目,故此試驗可用作細胞存活率的指標。(死細胞中的琥珀酸脫氫酶會消失,但不能將MTT還原)。

除了MTT試驗外,較為常見的就是alamarBlue試驗。alamarBlue是一種安全、穩定、易溶於水且對細胞無毒性的新型染劑,可以用螢光和可見光偵測。活細胞可以將藍色、無螢光性的氧化態alama Blue,透過粒線體中的NADH 去氫酶作用後,轉化變成紅色的還原態,透過偵測螢光 (Ex/Em: 560 nm/590 nm) 或吸光值 (570 nm及600nm) 即可記錄反應結果。alamarBlue的靈敏度較MTT與WST-1佳,因為alamarBlue的氧還電位(midpoint potential)高,比較容易搶電子變色;並且螢光偵測的靈敏度相對於可見光偵測也提升不少。在操作上也比較簡單,可以用螢光或是可見光機器來偵測;因為不須要以DMSO回溶,減少pipetting error,較MTT assay準確;由於靈敏度較佳,約100顆細胞即可反應。最為顯著的是alamarBlue無毒性,可以同時加入細胞培養液中即時進行藥物對細胞毒性的動力學分析或是進行需要時間點的觀察的實驗。

不論是MTT或是Alamar Blue都是利用偵測細胞的代謝活性來反應細胞存活率,因此無法分辨出細胞毒性的造成是因為活細胞數量減少或是代謝活性降低。反之,LDH Assay利用偵測細胞破損後釋放於培養基中的乳酸脫氫酶來反應細胞的死亡率,僅會偵測到死亡細胞。簡單的說,死細胞越多,所測得的讀值就會越高。當然,在進行細胞存活試驗前,還是需要評估實驗的方向,才能找到適合的偵測系統。

alamarBlue實驗數據

實際利用alamarBlue來偵測細胞在給予不同濃度的化合物作用下的存活。在波長570nm及600nm測量吸光值,代入公式換算成reduction rate (%)。即可得知在不同濃度的化合物作用下細胞的存活率進而算出IC50。

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